蛋白類生物制品中常見的表面活性劑
時間：2023-08-14 10:16:00 來源：創(chuàng)始人
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聚山梨（醇）酯20/80是生物制品中常見的非離子型表面活性劑，常見于蛋白類產(chǎn)品的輔料添加中。相比于離子表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉），非離子型表面活性劑避免了與帶電蛋白質(zhì)分子發(fā)生的強(qiáng)相互作用，而且毒性低且臨床耐受性好。
FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的近120款抗體類產(chǎn)品（單抗、雙抗和ADC），產(chǎn)品中的表面活性劑添加不低于產(chǎn)品總數(shù)的70%，聚山梨酯20和聚山梨酯80的添加又分別占到了其中的30%和70%左右，還有少量產(chǎn)品中添加了波洛沙姆188。聚山梨酯80是1986年第一個上市單克隆抗體產(chǎn)品（Orthoclone OKT3，1986）輔料之一，聚山梨酯類表面活性劑的常見使用濃度在0.01 mg/mL到1.0 mg/mL之間。
一般認(rèn)為表面活性劑的添加具有1）表面活性劑與蛋白類產(chǎn)品競爭氣-液的交界面，從而減低蛋白產(chǎn)品的暴露；2）降低產(chǎn)品與其接觸面（如管壁、瓶塞等）的非特異性吸附；3）增加產(chǎn)品的溶解度。
圖1：蛋白質(zhì)穩(wěn)定的不同機(jī)制示意圖聚山梨酯其實(shí)是一種混合物，主要為聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯組成的一種兩親性非離子表面活性劑。下圖為聚山梨酯80的合成過程示例。山梨醇首先脫水成脫水山梨醇（脫水山梨醇可以進(jìn)一步脫水成異山梨醇），脫水產(chǎn)物與環(huán)氧乙烷反應(yīng)并進(jìn)一步與油酸（或月桂酸）部分酯化，分別生成聚山梨酯80（或聚山梨酯20），產(chǎn)物中通常存在許多未酯化的分子（圖2）。
圖2：聚山梨酯80的合成。使用月桂酸代替油酸，以類似的方式合成聚山梨醇酯20。聚山梨醇酯是由不同脂肪酸酯組成的多相混合物，中國藥典要求聚山梨酯80和聚山梨酯20中的油酸含量范圍分別為不低于58.0%，月桂酸應(yīng)為40.0%～60.0%之間。一份數(shù)據(jù)顯示，不同供應(yīng)商間不同批次（A1-E3）聚山梨酯80均有差異（表2）。表2：不同供應(yīng)商間不同批次聚山梨酯80（PS80）差異（紅框標(biāo)注）
研發(fā)生產(chǎn)過程中應(yīng)考慮到產(chǎn)品輔料本身對產(chǎn)品的的影響，以確保最終產(chǎn)品的安全有效性，各國藥典要求市售產(chǎn)品必須滿足其最低標(biāo)準(zhǔn)才可允許其銷售（表3）。表1表明產(chǎn)品中聚山梨酯的實(shí)際使用量較低，實(shí)際采購時應(yīng)該考慮到訂購量的問題以防發(fā)生輔料變質(zhì)問題。表3：國際藥典描述了用于制藥目的的市售產(chǎn)品必須滿足的最低標(biāo)準(zhǔn)
除聚山梨酯原料之外，聚山梨酯本身也存在著降解風(fēng)險(xiǎn)而造成其中含有的物質(zhì)更加復(fù)雜。通常而言，聚山梨酯有酸/堿/酶催化的水解風(fēng)險(xiǎn)以及包括金屬離子在內(nèi)造成的氧化降解風(fēng)險(xiǎn)，聚山梨酯暴露于空氣、光和過渡金屬是導(dǎo)致其氧化的已知因素，酶介導(dǎo)的水解（一般由宿主蛋白介導(dǎo)）被認(rèn)為是在生物藥中觀察到的降解的主要原因?？贵w類產(chǎn)品使用的溶媒一般是生理鹽水或者無菌注射用水，聚山梨酯的降解產(chǎn)物中的游離脂肪酸溶解度差，是形成不溶性顆粒的的主要原因之一。
針對水解，實(shí)際產(chǎn)品中經(jīng)常會添加一定的緩沖輔料（如組氨酸（鹽）、磷酸鹽等），因此聚山梨酯所處的體系酸堿度變化應(yīng)該不大。宿主蛋白的殘留是一個棘手的問題，促使制劑產(chǎn)生多種聚集體以至于產(chǎn)生肉眼可見的顆粒，如蛋白質(zhì)二硫化物酶（PD19）、熱休克蛋白（DanK）等參與到了聚集進(jìn)程中，不僅如此，宿主蛋白也會導(dǎo)致制劑降解的發(fā)生，使聚山梨酯功能喪失而破壞制劑穩(wěn)定性。針對宿主蛋白殘留，上游可以通過對細(xì)胞系相關(guān)基因的敲減（在不影響實(shí)際生產(chǎn)條件下），細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化，下游可以通過優(yōu)化純化步驟來改善，應(yīng)該注意到高濃度抗體產(chǎn)品可能會伴隨高濃度酶雜質(zhì)的存在。當(dāng)然，過程中有可能含有具有酶活性的其他物質(zhì)，根據(jù)其性質(zhì)，應(yīng)該有針對性的去處理。針對金屬離子（一般為銅、鐵離子）在內(nèi)造成的氧化問題，一般可以通過添加依地酸二鈉來改善，而緩沖劑中常見的檸檬酸也可以起到絡(luò)合金屬離子的作用。針對幾種常見的緩沖體系中（組氨酸體系、檸檬酸體系、琥珀酸體系和磷酸緩沖體系），聚山梨酸酯在組氨酸緩沖液中的降解率最高（圖4）。該實(shí)驗(yàn)的組氨酸緩沖體系以及聚山梨酯的使用濃度接近實(shí)際獲批上市抗體類產(chǎn)品的實(shí)際使用濃度，提供了一定的借鑒意義。在配方篩查時，采用聚山梨酯為表面活性劑的產(chǎn)品中，配方中緩沖劑的選擇應(yīng)該是需要考慮的一種因素。值得注意的是近120款抗體類產(chǎn)品中有50%左右的產(chǎn)品中采用組氨酸緩沖體系，而組氨酸緩沖體系中有超過50%產(chǎn)品添加的表面活性劑為聚山梨酯。
實(shí)際的配方組成要考慮到多種成分的添加以及各種成分的比例以及實(shí)際的用量，正交實(shí)驗(yàn)可能是針對這樣變量繁多而復(fù)雜實(shí)驗(yàn)的良好解決方法。常見的分離方法是色譜法（如HPLC），檢測方法有紫外/可見光譜和熒光光譜、質(zhì)譜法等等。由于聚山梨酯本身的異質(zhì)性以及降解產(chǎn)物的復(fù)雜性，為其定性和定量表征提出了挑戰(zhàn)。由于聚山梨酯復(fù)雜的組成、異質(zhì)性和缺乏生色團(tuán)，開發(fā)和驗(yàn)證多山梨酸酯的分析方法是比較困難的。由于上述聚山梨酯可能存在的問題，其他的表面活性劑可能是替代其作用的良好輔料。FDA批準(zhǔn)上市的抗體類中還有一些產(chǎn)品采用泊洛沙姆188（P188）替代聚山梨酯作為表面活性劑。實(shí)際上P188 被批準(zhǔn)用于各種配方中，作為乳化劑、增溶劑和分散劑等。表4：FDA批準(zhǔn)上市含泊洛沙姆抗體輔料信息
Grapentin C等人研究了四種單抗在含有聚山梨酯或P188不同液體配方的玻璃瓶中穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)P188在脅迫(凍融、搖動)條件下提供與聚山梨酯相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效果（圖5）。
圖5：泊洛沙姆188和聚山梨酯對蛋白制劑保護(hù)效果聚山梨酯中的酯鍵存在酶解或化學(xué)水解問題，而P188的結(jié)構(gòu)對其則有良好的規(guī)避。但是P188的聚環(huán)氧乙烯鏈和聚環(huán)氧丙烷鏈的降解是否會形成不溶性顆粒，目前仍不清楚。Wang T等人研究表明，P188在組氨酸緩沖體系中的穩(wěn)定性表現(xiàn)不如檸檬酸緩沖體系，金屬離子的存在下，穩(wěn)定型也變得比較差（圖6）。GC-MS鑒定的物質(zhì)包括P188的典型自氧化產(chǎn)物乙酸、乙二醇及其低聚物和醇類、丙二醇及其低聚物和醇類以及各種乙二醇酯和丙二醇酯。此外，還觀察到一些PPO和PEO低聚物，這些降解產(chǎn)物對不同蛋白質(zhì)配方的影響還需要進(jìn)一步研究。
圖6：泊洛沙姆188在不同條件下的穩(wěn)定性抗體類注射制劑中作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的表面活性劑除聚山梨酯20/80以及P188外，泊洛沙姆家族中的P407、PEG脂肪酯（如聚乙二醇(15)-羥基硬脂酸酯）、非酯表面活性劑（如十二烷基葡糖苷和十二烷基麥芽糖苷）等均具有潛在的應(yīng)用價值。當(dāng)然，這些潛在的替代物也有潛在的短板，比如酯類表面活性劑可能存在與聚山梨酯相似包括酶解在內(nèi)的問題，但也不能忽視它們的可生物降解和生物相容性，這些輔料的對產(chǎn)品包括安全性以及有效性的影響還有待研究者們的進(jìn)一步探究。
林海球